En vista del papel vital de los biotioles en muchos procesos fisiológicos, el desarrollo de una sonda simple y eficiente para la detección de biotioles es de gran importancia médica. En este trabajo, demostramos el uso de la 2,3-dicloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinona (DDQ), que responde rápidamente a los biotioles, especialmente al glutatión, como una nueva sonda fluorescente para la detección selectiva y la bioimagen de los biotioles. Esta nueva sonda fluorescente puede distinguir fácilmente el glutatión de la cisteína y la homocisteína bajo una concentración fisiológica y detectar el glutatión rápidamente en tres minutos. Esta sonda presenta una alta selectividad hacia los biotioles y el límite de detección se determinó en 3,08 × 10-9 M para el glutatión, 8,55 × 10-8 M para la cisteína y 2,17 × 10-9 M para la homocisteína, respectivamente. El mecanismo de detección se exploró más a fondo mediante experimentos de teoría funcional de la densidad (DFT) y de resonancia magnética nuclear (RMN); los resultados mostraron que las fuerzas de interacción entre la sonda y los biotioles eran de interacción electrostática. Además, la sonda se ha aplicado con éxito a la detección de biotioles en células Eca9706 mediante tecnología de imagen confocal de fluorescencia.