Se ha desarrollado un procedimiento espectrofotométrico novedoso, sencillo y más sensible para la determinación de la vitamina B2 (riboflavina) mediante una extracción acuosa en dos fases (ATPE). Una ATPE está formada principalmente por agua y no requiere un disolvente orgánico. Otros componentes del ATPE utilizados en este estudio fueron el polímero, polietilenglicol (PEG), y algunas sales como Na2SO4 y Na2CO3. El método se basa en la interacción entre la vitamina B2 (riboflavina) y el sulfato sódico (Na2SO4) en un medio ácido (pH 6,4). Se estudiaron y optimizaron las influencias de parámetros eficaces como la sal (tipo y concentración), el polietilenglicol (peso molecular y concentración), la temperatura, el tiempo de centrifugación y el pH de la solución de muestra. El rango lineal fue de 1,3-320 ng/mL (R2=0,9991; n=10) con una desviación estándar relativa (RSD) para 60 ng/mL del 3,68%. El límite de detección (LOD) calculado a partir de tres veces la desviación estándar del blanco fue de 0,2 ng/mL y se obtuvieron recuperaciones del análisis de muestras reales entre 94,82 y 103,98% para la determinación de vitamina B2 (riboflavina) en orina y muestras farmacéuticas.