La síntesis de proteínas sin células (CFPS) es un método utilizado para producir proteínas sin los límites de viabilidad celular. La utilidad de plug-and-play de CFPS es una ventaja clave sobre los sistemas de expresión basados en plásmidos tradicionales y es fundamental para el potencial de esta biotecnología. Una limitación clave de CFPS es la variabilidad de la estabilidad de los tipos de ADN, lo que limita la efectividad de las reacciones de síntesis de proteínas sin células. Los investigadores generalmente confían en el ADN plasmídico por su capacidad de soportar una expresión robusta de proteínas. Sin embargo, los costos adicionales necesarios para clonar, propagar y purificar plásmidos reducen el potencial de CFPS para la prototipación rápida. Mientras que las plantillas lineales superan los límites de la preparación de ADN plasmídico, las plantillas de expresión lineal (LETs) se utilizaron poco debido a su rápida degradación en sistemas de CFPS basados en extractos, limitando la síntesis de proteínas. Para alcanzar el potencial de CFPS utilizando LETs, los investigadores han logrado un progreso notable hacia la protección y estabilización de las plantillas lineales a lo largo de la reacción. Los avances actuales van desde soluciones modulares, como la suplementación de inhibidores de nucleasas y la ingeniería genómica para producir cepas que carecen de actividad de nucleasa. La aplicación efectiva de técnicas de protección de LET mejora los rendimientos de expresión de proteínas objetivo para igualar los de la expresión basada en plásmidos. El resultado de la utilización de LET en CFPS es la rápida creación de ciclos de diseño-construcción-prueba-aprendizaje para apoyar aplicaciones de biología sintética. Esta revisión describe los diversos mecanismos de protección para las plantillas de expresión lineal, ideas metodológicas para la implementación y propuestas para esfuerzos continuos que podrían avanzar aún más en el campo.