Las propiedades digestivas del almidón son cruciales para determinar las excursiones glucémicas postprandiales. Genisteína, un fitoestrógeno activo, tiene el potencial de influir en las tasas de digestión del almidón. Investigamos la forma en que la genisteína afectaba las propiedades digestivas del almidón in vitro. Realizamos cinéticas enzimáticas, espectroscopía de fluorescencia, acoplamiento molecular y simulaciones de dinámica molecular (MD) para analizar las propiedades inhibitorias de la genisteína sobre las enzimas digestivas del almidón, así como para aclarar el mecanismo de acción relevante. Nuestros hallazgos demostraron que, tras la adición del 10% de genisteína, los contenidos de almidones de digestión lenta y resistente aumentaron en un 30.34% y 7.18%, respectivamente. La genisteína inhibió la alfa-amilasa y la alfa-glucosidasa, con concentraciones inhibitorias medias de 0.69 +/- 0.06 y 0.11 +/- 0.04 mg/mL, respectivamente. La genisteína exhibe un efecto inhibitorio reversible y no competitivo sobre la alfa-amilasa, mientras que su inhibición sobre la alfa-glucosidasa es de tipo mixto reversible. La espectroscopía de fluorescencia indicó que la presencia de genisteína causó una disminución en la intensidad de fluorescencia de las dos enzimas digestivas. El acoplamiento molecular y las simulaciones de MD mostraron que la genisteína se une espontáneamente a la alfa-amilasa a través de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y apilamiento, mientras que se une a la alfa-glucosidasa mediante enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. Estos hallazgos sugieren el potencial de desarrollar la genisteína como un agente farmacológico para regular las excursiones glucémicas.