Se describe un biosensor amperométrico de tres electrodos para la detección de dos sacáridos diferentes (lactosa y glucosa) en soluciones acuosas. En el electrodo de trabajo de grafito se coinmovilizaron mediante enlace covalente la glucosa oxidasa (GOD) y la β-galactosidasa (β-gal). Se investigó la respuesta del biosensor en función de la concentración relativa de las dos enzimas inmovilizadas y se identificaron las mejores condiciones de trabajo midiendo la sensibilidad y la respuesta de rango lineal. En particular, nuestro mejor biosensor de lactosa muestra un rango lineal de hasta 0,010 mM y un límite de detección (LOD) y una sensibilidad iguales a 0,001 mM y 850 ± 81 μA/mM, respectivamente. Para la glucosa, los valores de los parámetros mencionados son iguales a 0,015 mM para el rango lineal, 0,001 mM para el LOD y 505 ± 55 μA/mM para la sensibilidad. Los parámetros de trabajo de nuestros biosensores son significativos en comparación con otros biosensores desarrollados para la determinación de la concentración de los dos sacáridos investigados en el presente trabajo. En particular, se obtienen sensibilidades bajas (LOD) y altas para la lactosa y la glucosa. Para poner a prueba nuestro biosensor con muestras reales, se ensayó con zumos de frutas, leche desnatada y suero de leche.